東北大学薬学部薬品分析化学講座（現大学院薬学研究科臨床分析化学分野）では、生体試料を対象とする信頼度の高い測定法が欠けていることが、胆汁酸の生体内意義、病態との関連等を解明するうえで大きな隘路であることに注目し、有機化学的手法と分析化学的手法を組み合わせてそれらの高感度測定法の開発を行うとともに、臨床の研究者と連携して実試料の測定とその解析を行ってきた。ここでは、1975年頃から35年間ほどの研究内容を簡単に概要として纏めてみた。
1966年9月に南原利夫教授（現東北大学名誉教授）が着任後、従来の「薬品の分析化学」から、複雑なマトリックス中の生理活性物質を測定対象とする新規学問領域「臨床分析化学」の構築に向けて新たな研究を開始した。1）非破壊性、2）微小差の弁別、3）高感度・高選択性を備えた分離分析法の開発という理念を基盤とし、草創期の10年は、ステロイドホルモン、強心性ステロイド等を取り上げ、立体・位置構造異性体、新規抱合体等の合成や、それらの立体構造解析等を含む基礎力養成に注力した。1970年頃よりイムノアッセイ、液体クロマトグラフィー（HPLC）といった親水性化合物の測定に威力を発揮する分析手法の出現と相俟って各種生体内微量成分の直接分析法の開発、すなわち臨床分析化学研究に移った。
この時期は胆汁酸研究においても大きな転換期であり、A. F. Hofmann教授によるケノデオキシコール酸（CDCA）の胆石溶解作用が報告され、臨床から精度の高い胆汁酸測定法が求められ始めた時でもある。1975年頃に、HPLCによる遊離型、グリシン抱合型、タウリン抱合型計15種の直接分析法に着手し、翌年には島田和武助教授（現金沢大学名誉教授）が分離条件をほぼ設定した（1）。しかし、複雑なマトリックスである生体試料測定のための前処理という考えがまだ確立されていない時期であり、実試料への適用が困難であった。そこで、研究を引き継いだ後藤順一助手（現東北大学名誉教授）が、Sephadex-LH-20を化学修飾してピペリジンをイオン交換基として導入したpiperidinohydroxypropyl Sephadex-LH-20（PHP-LH-20）を開発して、HPLCによる胆汁中胆汁酸の一斉直接分析法を世界に先駆けて報告した（2）。
胆汁酸の分析にはよくHPLCが用いられる。そこで、基礎となる溶出挙動について述べておきたい。胆汁酸のHPLC分析では、移動相の液性により分離の様相が大きく異なる。弱酸性条件下では、酸性官能基のpKaが異なることから24位の抱合形式による分離は十分だが、ジヒドロキシ体のCDCAとデオキシコール酸（DCA）の分離が明確でない。一方、中性～弱塩基性条件では、両者の分離は明確になるが、抱合形式による分離が悪くなる。前述のPHP-LH-20の導入は、こうしたHPLCの弱点を補完したものであり、生体試料分析に前処理用器材という概念を初めて導入したものでもある。
移動相の液性によるCDCAとDCAの分離の様相は、新たに合成した各種胆汁酸異性体標品を用いた詳細な検討から次の様に明らかになっている。胆汁酸の一斉分離にはODS系等の疎水性固定相が利用される。この時24位酸性官能基は、移動相の液性によってその解離状態が異なり、非解離状態では固定相と、解離状態では移動相との相互作用が優先する結果、酸性の移動相を用いると酸性度の強さに応じてタウリン抱合型、グリシン抱合型、遊離型の順に溶出され、中性～弱塩基性では何れも解離型になる結果、抱合形式による分離が悪くなる。一方、ステロイド核と固定相との疎水性相互作用には胆汁酸のβ側が、移動相との相互作用には主として水酸基のあるα側が関与する。したがって、α側に同じ数の水酸基を持つCDCAとDCAは性質がよく似ているため分離がよくない。ところが、24位酸性官能基が解離している中性～弱塩基性条件下では、立体的距離が近い12α位の水酸基と酸性官能基との間で分子内相互作用（水素結合）が生起し（24位側鎖がステロイド核の下に潜り込んだ形となる）、逆に酸性官能基と移動相との相互作用が弱まる。これに対して7位水酸基は離れているためこうした相互作用を起さない結果、DCAがCDCAより遅く溶出され、両者の分離がよくなる。一方、ウルソデオキシコール酸（UDCA）は、特徴として7β位に水酸基を持ち、これが先に述べたステロイド核と固定相との間の基本的な疎水性相互作用を大きく妨害する結果、ジヒドロキシ体にもかかわらずCDCAやDCAだけでなく、トリヒドロキシ体のコール酸（CA）よりも早く溶出される。UDCA はこうした HPLC上の溶出挙動から、しばしば親水性胆汁酸と呼ばれることがあるが、これは物性を意味する親水性とは異なり、7β位水酸基という特異な立体構造によるものである。同じような分子内相互作用は3-グルクロニドでも見られ、3α位のグルクロン酸と 7α位の水酸基との間でも生じる。こうした分子構造の特性を知ることは、生体内における胆汁酸の機能解析でも有効であろう。例えばOATP1B1や1B3は胆汁酸の5β構造と3α位水酸基を認識する。したがって24位カルボキシ基にグリシンの類縁体としてリジンを導入し、ε位のアミノ基に発蛍光団を導入した基質が機能解析に有用となる（3）。
15種胆汁酸の直接分析法の開発に続いて、各種3-、7-、12-モノサルフェート、3,7-、3,12-、7,12-ジサルフェート、3-クルクロニド、24-アシルグルクロニド、N-アセチルグルコサミニド異性体をそれぞれ新たに合成してHPLCによるそれらの一斉分析法を構築し、胆汁、尿等生体試料の測定を行った。これらHPLC分析については纏めて記載しているので、成書を参照されたい（4−6）。
胆汁酸は、分子内に発色団、発蛍光団といった検出器に対して高感度に応答する原子団を持っていないため、直接分析では感度が低く、胆汁酸のHPLC分析における大きな欠点となっている。このため、側鎖カルボキシ基を利用する誘導体化法が工夫されたが、酸性官能基の修飾により、結果的に中性物質に誘導するため、先に述べた側鎖酸性官能基による特異な溶出挙動を利用できなくなる。そればかりか、タウリン抱合体は誘導体化を受けないため、いったん加水分解して遊離型にする必要がある。そこで、何れの胆汁酸も3α位に水酸基を持つことに着目し、アシールニトリルという新たな反応活性基を持つ水酸基用の試薬を初めて開発し、検出感度10 pgほどの誘導体化法を考案し、血中胆汁酸の一斉分析を可能にした（7）。尚、現在では質量分析法（MS）と組み合わせたLC/MSによる直接分析で数pgの感度が得られる（8）。
肝組織中の胆汁酸測定にも強い要望があった。しかし、誘導体化法でも全く感度が足りなかった。当時分離と感度に優れる方法として、ガスクロマトグラフィー（GC）/MSが広く利用されており、誘導体化が必要ではあるものの検出感度は数pgであったが、バイオプシーで得られる肝組織試料に対してはこれでも十分ではなかった。この手法では、電子イオン化により直接・間接的に生じる測定対象化合物の正イオンが用いられるが、イオン化室内に共存するガス成分により同時に生成したバックグラウンドノイズの妨害でこれ以上の感度が得にくい。一方、電子イオン化の原理からイオン化室内では負イオンの生成はほとんど見られない。そこで、カルボン酸の誘導体化法に詳細な吟味を加え（9）、pentafluorobenzyl（PFB）エステルに誘導すると胆汁酸の負イオンが高効率で生成することを見出し、2 fg（フェムトグラム、10-15グラム）という従来の1,000 倍に達するアト（10-18）モルレベルの超高感度を得ることに成功するとともに、肝組織中胆汁酸の分離測定を可能とした（10）。生体試料の測定では、一連の操作過程での損失や、検出器に対する応答性の違い等を補正し、正確度の高い測定結果を得るために測定対象物と物性がよく似た内標準物質（IS）が極めて重要となる。とりわけ超高感度分析では必須となる。本法では、ステロイド核上水酸基の酸素原子に18Oを導入する方法を考案し、3、7、12位に1～3個の18Oを導入した胆汁酸を合成し、ISとして用いている。この手法は、Zellweger syndrome患者尿中のC27胆汁酸の測定にも応用されている（11）。
18O標識体を胆汁酸の生合成機構の解明に利用した例を紹介する。胆汁酸はコレステロールより生合成されるが、最初のステップはステロイド核上の7位、さらには12位に水酸基が導入され、次いで24位が酸化されて、C27胆汁酸（dihydroxy-およびtrihydroxy-cholestanoic acid、それぞれDHCA、THCA）へと変換し、ペルオキシソームでの一連の酸化的開裂反応（脱水素反応によるΔ24体、それの水付加、次いで酸化と開裂）を経てC24胆汁酸へと導かれる。この開裂反応の契機がアシルCoAエステルへの変換であり、脂肪酸のβ-酸化と同じであるとされている。脂肪酸の脱水素反応では、2位及び3位のproRの水素が立体特異的に脱離するanti-eliminationで進行し、acyl-CoA oxidaseがこれを触媒する。一方、胆汁酸については広島大学穂下グループにより、25R-、25S-C27胆汁酸から生成するΔ24体は、何れの場合も24E体であることが明らかにされており、acyl-CoA oxidaseが立体異性体を認識していないように見える。そこで24位と25位に立体特異的に2Hを導入した25R-及び25S-THCA、さらには18O標識25R-及び25S-THCAを合成し、 LC/MS及びGC/MSで検討し、25R-THCAはCoAエステルになった後、ペルオキソームに存在する異性化酵素により25S体に変換され、脂肪酸と同様anti-eliminationで脱水素反応を受けることを明らかにした（12−14）。これに先立って、Zellweger syndrome患者尿中THCAの測定において、アシルCoAエステルを経て生合成されるグリシン、タウリン抱合型では、25R体と25S体がほぼ同量存在するのに対し、遊離型では25R体しか検出されないことを認めており（15）、これらの知見を合わせるとコレステロールより25R-C27胆汁酸が生合成され、アシルCoAエステル化後異性化反応を受けて25S体に導かれ、acyl-CoA oxidaseによりC-24胆汁酸へと誘導されると説明される。尚、この異性化反応は、同様に異性化反応を受けることが知られている2-アリールプロピオン酸系抗炎症薬の添加で抑制されとことから、この異性化酵素は2-置換プロピオン酸構造を認識していると考えられる。
胆汁酸3-グルクロニドの尿中濃度は3-サルフェートに比して極めて低濃度であった。一方、C23ノル胆汁酸ではカルボン酸を介したアシルグルクロニドの存在が知られている。標品を合成し（16）、ラット肝ミクロソーム画分の活性と、その特性を吟味するとともに（17, 18）、直接分析法を確立し、尿中24-アシルグルクロニドを測定したところ、健常人ではCA、CDCA、UDCA、LCA はほとんど検出されないのに対し、DCAでは100 nmol/mL程度排泄されていることを明らかにした（19）。また、本アシルグルクロニドは活性で、非酵素的にタンパク質と結合し、アマドリ転位を起こして不可逆的な付加体を生成することも証明した（20）。
先に記した胆汁酸アシルCoAエステルの生合成は、脂肪酸と同様acyl-CoA synthetaseにより触媒され、acyl-adenylateを経ることを証明したが（21, 22）、中間体であるacyl-adenylateがアシルグルクロニドよりもはるかに活性で、非酵素的条件下で容易にアミノ基を介してタンパク質と結合すること、またその反応性は弱酸性にすることでコントロールできることも見出した（23）。引き続き眞野講師（現東北大学教授・病院薬剤部長）は、このacyl-adenylateをこれまでなかった水溶性アフィニティーラベル化剤として活用することを図り、抗体と抗原のバインディングサイトの解析に適用し（24）、DCAと特異的モノクロナール抗体結合時のタンパクモデルを示した（25）。さらに細胞内にはacyl-adenylateの生成に不可欠なATPがふんだんに存在することから、大腸がんとの関係から注目されるヒストン、さらにはDNAとの付加体生成の可能性に吟味を加え、前者では非酵素的条件下ヒストンH3に特異的に（26）、後者でも生理的条件下容易に付加体を生成することを証明し（27）、生体内でもこうした反応が生起する可能性を示した。
脳内には胆汁酸生合成の前駆体である24-hydroxycholesterolが多量存在するが、胆汁酸は存在しないと考えられていた。著者らは、脳内タンパク質と強く結合した状態で存在することを想定し、ラット脳細胞質画分を高濃度グアニジン存在下でエタノール抽出し、LC/MS 分析に付したところ、1.606 ± 0.701 nmol/g tissueと多量のCDCAを検出した。CA、DCAはそれぞれ0.115 ± 0.188 nmol/g tissue、0.064 ± 0.052 nmol/g tissueであり、突出してCDCAが高濃度であった（28）。因みにこの時の血中濃度は、CDCA 0.054 nmol/mL、CA 0.231 nmol/mL、DCA 0.107 nmol/mLであり、血液由来CDCAではなく、脳内そのものであることは明らかである。すでに肝における胆汁酸の生合成では、7β位の水酸化から始まる通常のルートの他、最初に側鎖が切断された3β-hydroxy-5-cholenoic acidが7位水酸化を経てCDCAになる経路の存在も指摘されている。脳内における同様酵素の存在を明らかにするため、24位カルボキシ基に18Oを標識した3β-hydroxy-5-cholenoic acidを合成して検討を加えたところ、容易にCDCAが生成されることを見出した（29）。このことは多量に存在する24-ヒドロキシコレステロールの脳内からの除去機構を示唆していよう。
胆汁酸と結合する脳内のタンパクについても検索した。特定の結合タンパク質を特異的に抽出する器材としてジスルフィドリンカーを介して胆汁酸のような機能性小分子を不溶性担体に固定化したcleavable affinity gelを新たに開発し（30）、ラット脳内の画分をCDCA固定化affinity gelで抽出し、MS分析にて精査した。その結果、大脳、中脳、小脳、脳幹、海馬画分からはtubulin-α、-β、actin-β、14-3-3 protein-ζ、-δが同定された。一方、下垂体画分からはgrowth hormone（GH）が同定された。下垂体切除ラットではCDCAのプールサイズが著しく減少し、GH欠乏患者にGHを投与すると胆汁酸生合成が亢進し、CDCAプールサイズが回復される等、胆汁酸とGHとが相互に深く関連することがすでに報告されている。そこで、先のCDCA acyl-adenylateをアフィニティーラベル化剤とし、GHと弱酸性条件下でインキュベートし、次いで液性を弱塩基性にしてラベル化反応を進行させ、その生成物をプロテオミクス手法にて解析し、CDCAがGHのLys55、Lys196、Lys205に結合しているを明らかにした（31）。これらのLysはGHのレセプター結合部位とは異なる一つの空間（ポケット）に存在しており、CDCAとの特異的結合部位を示唆している。
以上、有機化学的手法を基盤に信頼度の高い高感度、高選択的胆汁酸測定法を構築し、広く提供するとともに、その手法を胆汁酸の生体内意義の解明に役立ててきた一連の研究概要を示した。今後胆汁酸研究に携わる方々の参考になれば幸いである。
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