筆者の胆汁酸研究は、今から37年前(1979年)に東北大学名誉教授・星薬科大学名誉教授の南原利夫先生との日本分析化学会での偶然の出会いから始まった(開催地は日本大学工学部で当時筆者が所属し、当該年度の日本分析化学会学会賞受賞者として南原先生が特別講演者として出席)。その時以来南原先生から、ステロイド研究(胆汁酸、強心性ステロイド、ステロイドホルモン等)に対するあくなき情熱と夢をお聞きするうち、いつしか筆者自身もステロイド研究の虜になっていた(研究の初期の期間は主に植物油からの新規ステロール成分に関する研究をおこなっていた)。1980年、南原先生より南アラバマ大学医学部・生化学教室を主宰するFrederic C. Chang教授の研究室でのポストドクトラルフェロー留学のお話を頂いた(Chang教授は著名な有機化学者であるLouis F. Fieser教授の門下生で、ステロイドの合成化学的研究を行っていた)。そこで、1.5年間胆汁酸の合成化学的研究を学んだことがその後の筆者の研究生活に大いに役立った。さらに1995年には、カリフォルニア大学・サンジェゴ校・医学部のAlan F. Hofmann教授(現在同大学 名誉教授)の研究室に半年間客員教授として在籍する機会も得て、胆汁酸研究の面白さにさらにのめり込んでいった。以降〜現在まで、筆者は以下の主題①~③について研究してきたが、本稿では特に③について焦点を絞って簡単に紹介する。
① ヒト生体試料及び脊椎動物の胆嚢胆汁から新規胆汁酸の単離と同定・構造決定並び に体内動態の解明。
② GC、HPLC、MS、NMRによる胆汁酸異性体のキャラクタリゼーションと高感度・高選択分離分析法の開発。
③ 新規な異常胆汁酸立体異性体の化学合成法。
胆汁酸研究に多大な足跡を残したA. F. Hofmann名誉教授「脊椎動物の胆汁酸:構造変化と生物進化の意義」(1)、「胆汁酸の化学、生物学と臨床応用における鍵となる発見:過去80年の歴史」(2)と、Jan Sjövall名誉教授「健常人及び疾患者の胆汁酸とステロイドの50年史」(3)の定年退職に当たって発表された総説をここに付記しておく。
生体内胆汁酸の分析には、従来、分離能、感度に優れるガスクロマトグラフィー質量スペクトル(GC-MS)法や、近年では抱合型胆汁酸を何ら水解することなく直接分析可能ならしめる液体クロマトグラフィー質量スペクトル(LC-MS)法が繁用されている。しかしながら、これらの手法を用いても標的胆汁酸の正確な化学構造、特にヒドロキシル基の位置とその立体配置に関する知見は入手出来る生体試料量の制約もあり、容易に知ることが出来ない。つまり、最終構造決定は、化学合成ルートを明らかにした信頼度の高い合成標品との直接対比が不可欠である。
胆汁酸は肝におけるコレステロール異化代謝産物のうちで最も主要なものであり、肝細胞の作用にによって一次胆汁酸であるコール酸(CA)とケノデオキシコール酸(CDCA)に変換される。次いで一次胆汁酸は、腸内細菌の作用を受け、二次胆汁酸であるリトコール酸(LCA)、デオキシコール酸(DCA)、あるいはウルソデオキシコール酸(UDCA)に変換されて、食物脂肪の消化吸収を助ける作用を司る。このように通常、胆汁酸といえば、CA, CDCA, LCA, DCA, UDCAの5種とそれらにグリシンあるいはタウリンがN-アシルアミド結合した抱合体の計15種を指し、これらは常胆汁酸(英語名ではcommon bile acids、normal bile acids、typical bile acids、usual bile acids等と称されている)と呼ばれている。常胆汁酸の化学構造は5β-ステロイド骨格(シス-A/B環融合)のC-3、C-7、あるいはC-12位に1〜3個のヒドロキシル基とC-17位イソペンタン側鎖末端にカルボキシル基を持つC24のヒドロキシカルボン酸誘導体である。
一方近年、胆汁酸分析法の飛躍的進歩に伴い、常胆汁酸以外の代謝異常成分がヒト体液中から見出され、これらの体内動態が各種肝胆道疾患と密接な関わりのあることが示唆され、注目されている。すなわち、肝胆道疾患においては、肝酵素系の欠損あるいは酵素活性低下の結果、胆汁酸の生合成あるいは代謝に障害をきたし、異常胆汁酸(英語名ではuncommon bile acids、abnormal bile acids、atypical bile acids、unusual bile acids、unique bile acids等と称されている)を特異的に出現させ、これが疾病の診断バイオマーカーになるものと期待されている。異常胆汁酸とは常胆汁酸以外の成分、すなわちステロイド核内あるいは側鎖にさらにヒドロキシル基、ケトン基、不飽和結合有する化合物、ステロイド骨格の融合形式の異なるアロ胆汁酸(5α-H、トランス-A/B環融合)、側鎖炭素数の異なるC29〜C25、C23、C22の高級あるいは低級胆汁アルコールや高級胆汁酸など実に多種多様な成分である。さらに異常胆汁酸は抱合型式の種類(非抱合型やグリシン、タウリン のようなN-アシルアミド抱合体、スルフェート抱合体やグルクロン酸、N-アセチルグルコサミン、グルコース、ガラクトースなど単糖とのエーテルあるいはエステルグリコシド抱合体並びにそれらの多重抱合体)や抱合部位、さらには抱合数による違いもある。
筆者らは異常胆汁酸標品としてこれまでに以下に記する化合物の合成を達成した(記号“ξ”はステロイド環内ヒドロキシル基のα-とβ-配置を示す)。コール酸からケノデオキシコール酸(CDCA)の新規合成法(4)、CDCAからウルソデオキシコール酸(UDCA)の新規合成法(5)、グリシン及びタウリン抱合型胆汁酸の改良合成法(6)、3ξ,7ξ-ジヒドロキシ-5β-コラン酸(7)、3ξ,7ξ,12ξ-トリヒドロキ-5β-コラン酸(8)、7ξ,12ξ-ジヒドロキシ-5β-コラン酸(9)、3ξ,12ξ-ジヒドロキシ-5β-コラン酸(10)、3ξ,7ξ-ジヒドロキシ-5α-コラン酸(11)、7ξ,12ξ-ジヒドロキシ-5α-コラン酸(12)、3ξ,7ξ,12ξ-トリヒドロキ-5α-コラン酸(13)、3ξ,6ξ-ジヒドロキシ-5β-コラン酸(14)、 3ξ,6ξ,7ξ-トリヒドロキ-5β-コラン酸(15)、4β-ヒドロキシ胆汁酸(16)、3α,6ξ,7ξ,12α-テトラヒドロキ-5β-コラン酸(17)、2β-ヒドロキシ胆汁酸(18)、3ξ,6ξ,12α-トリヒドロキ-5β-コラン酸(19)、3α,6ξ,7β-トリヒドロキ-及び3α,6ξ,7β,12α-テトラヒドロキ-5α-コラン酸(20)、3ξ,6ξ-ジヒドロキシ-及び6ξ-ヒドロキシ-5α-コラン酸(21)、アロケノデオキシコール酸とアロコール酸の改良合成法(22)、ヒオデオキシコール酸 3-及び 6-グリコシド抱 合体(23)、胆汁酸 3-グルコシドとグリシン、タウリン抱合体(24)、3α,7α,16ξ-及び3α,7α,15ξ-トリヒドロキシ-5β-コラン酸(25)、(22E)-3α,6β,7β-トリヒドロキシ-22-5β-コレン酸とタウリン及びグリシン抱合体(26)、3α,7α,14α-トリヒドロキ-5β-コラン酸(27)、胆汁酸24-ガラクトピラノシド・エステル抱合体(28)、3β,7β-ジヒドロキシ-5-コレン酸の3-スルフォオキシ-7-N-アセチルグルコサミン-24-アミド抱合体(29)、3β-スルフォオキシ-7β-ヒドロキシ-24-ノル-5-コレン酸(30)、(22E)-3α,6α,7α,12α-テトラヒドロキ-22-5β-コレン酸とグリシン、タウリン抱合体(31)、(25R)-/(25S)-3α,7α,12α-トリヒドロキ-5α-コレスタン酸とグリシン、タウリン抱合体(32)、7α,12α-ジヒドロキシ-4-コレステン-3-オンと12α-デオキシ体(33)、4α-及び4β-ヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール(34)、胆汁酸N-メチルタウリン抱合体(35)、共役エノン(∆1-及び∆4-3-ケトン)型ステロイドの一段階合成(36)、(22R)-/(22S)-3α,7α,12α,22-テトラヒドロキ-5β-コラン酸と12α-デオキシ体(37)、の化学合成について報告した。
例えば、新生児、胎児の生体試料中には1β-及び6-ヒドロキシ胆汁酸が、Zellweger’s 症候群ではC27とC29の高級胆汁酸が、脳腱黄色種症(CTXではC23短側鎖胆汁酸と(23R)-ヒドロキシ胆汁酸が顕著に排泄されることがそれぞれ報告されている。最近、東北大学病院薬剤部(眞野成康教授主宰)と筆者らの共同研究で、Niemann-Pick C型病 (NPC) 並びに3β-ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ(3β-HSD)欠損症疾患者尿中に3β-スルフォオキシ-7β-N-アセチルグルコサミン-5-コレン酸とそのグリシン、タウリン抱合体が顕著な量で存在することを合成標品との対比から明らかにし、これらが当該疾患の確定診断バイオマーカになりうるものと期待されている(38-40)。
ステロイド骨格のA及びB環に置換基を有する化合物からC、D環の不活性なメチン、メチレン炭素に直接官能基(ヒドロキシル基やオキソ基)を導入する方法として、微生物による酸化反応やβ-(p-ベンゾイルフェニル) アルカン酸エステルによる光化学反応が知られている。筆者らはジメチルジオキシラン(DMDO)がステロイドの不活性なメチン及びメチレン炭素の遠隔含酸素官能基化に極めて有効であることを見出した(41-43)。例えば、DMDOを3α-アセトキシ-5β-コラン酸メチルに作用させると、対応する5β-ヒドロキシ-及び5β,17α-ジヒドロキシ体が一段階(収率48、36%)で得られた。さらに、メチル(トリフルオロメチル)ジオキシラン(MTDO)やエチル(トリフルオロメチル)ジオキシラン(ETDO)の有効性についても明らかにした(44)。その応用例として、CDCAとUDCAのジアセテート体にDMDOを反応させると、それぞれの17α-と14α-ヒドロキシ体が主成分として得られ(27)、これらを数段階の工程を経て、それぞれ対応する16α-と16β-ヒドロキシ胆汁酸並びに 15α-と15β-ヒドロキシ胆汁酸の立体異性体に変換する短段階合成ルート法を開発した(25)。
シトクロムP-450のモデル化合物として、触媒としてルテニウムポルフィリン錯体[Ru(TMP)CO]とHBr、酸素ドナーとして2,6-ジクロロピリジ-N-オキシド(DCP N-オキシド)(45-47)、あるいはオスミウムポルフィリン錯体[Os(TMP)CO]と酸素ドナーとしてtert-ブチルハイドロペルオキシド(TBHP)(48, 49)をステロイドに作用させると、不活性な炭素への高効率な遠隔含酸素官能基化が起こることも見出した。例えば、3-オキソ-5β-コラン酸メチルをDCP N-オキシド/Ru(TMP)CO系で酸化させると、対応する5β-ヒドロキシ体、3-オキソ-∆4体と共に(20S)-O-24,20-ラクトン、(20S)-5β-ヒドロキシ-O-24, 20-ラクトンを主成分として、一方、同じ基質をTBHP/Os(TMP)CO系で酸化すると微量の5β-ヒドロキシ体、3-オキソ-∆4体と共に主成分として3,4-seco-3,4-ジカルボン酸誘導体がそれぞれ一段階で生成した。また、3α,7α-ジアセトキシ-5β-コラン酸メチルエステルを反 応基質に用いると、対応する5β-ヒドロキシ体(47%)と5α-ヒドロキシ体(6%)がそれぞれ得られた。本法の応用例として、24-アルキルオキシステロールから対応する(24R)-/(24S)-24-ヒドロキシ-24-メチル体及び(24R)-/(24S)-25-ヒドロキシ-24-メチル体への一段階合成に成功した(50)。
以上、ヒト体液中に存在すると思われる異常胆汁酸(胎児性胆汁酸も含む)の立体選択的化学合成法を紹介した。異常胆汁酸が肝胆道疾患と密接な関係にあり、その出現が疾病の特異的バイオマーカーになりうるものと期待されているものの、その生成機序、生合成 経路、代謝、排泄ルートについては、未解明の点も多い。近未来、これらの諸問題が解明され、各種肝胆道疾患の病態と異常胆汁酸との関連が解明され、疾病の早期発見、早期治療のみならず病因解明に大きく寄与されることが期待される。
本研究を遂行するにあたり多くの方々のお世話になった。とりわけ、東北大学の南原利夫名誉教授、後藤順一名誉教授、眞野成康教授、カリフォルニヤ大学・サンジエゴ校のAlan F. Hofmann名誉教授、広島国際大学の宇根瑞穂教授、順伸クリニック・胆汁酸研究所の入戸野博先生と武井一先生には多大なご協力とご援助を頂き、ここに記して感謝申し上げます。
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